VALIDASI ANALISIS DNA BABI DENGAN POCKIT NUCLEID ACID ANALYZER

Validation of Pig Analysis With Pockit Nucleid Acid Analyzer Drh Meetha Ramadhanita

UPTD Pelayanan dan Pengujian Veteriner Dinas Pertanian Provinsi Banten

Abstract

Validation of the analysis method is an assessment of certain parameters, based on laboratory experiments, to prove that these parameters meet the requirements for their use.

This study aims to provide validation information on the Qualitative Polymerase Chain Reaction Method of the Pockit Nucleid Acid Analyzer in the analysis of Pig DNA used at the UPTD Pelayanan dan Pengujian Veteriner Provinsi Banten.

(Key words : Validation, Beef, Pork, Polymerase Chain Reaction (PCR), Pockit Nucleid Acid Analyzer)

Abstrak

Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap  parameter  tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Penelitian ini bertujuan untuk memberikan informasi validasi Metode Polymerase Chain Reaction Qualitative dari alat Pockit Nucleid Acid Analyzer dalam analisis DNA Babi yang digunakan di UPTD Pelayanan dan Pengujian Veteriner Provinsi Banten.

(Kata kunci : Validasi, Daging sapi, Daging Babi, Polymerase Chain Reaction (PCR), Pockit Nucleid Acid Analyzer)

Pendahuluan

Provinsi Banten berada di posisi strategis yakni diporos perlintasan jawa dan sumatera, sehingga lalu-lintas produk hewan sangat tinggi. Hal ini menyebabkan resiko adanya pemalsuan daging diantaranya dengan pemalusuan atau penambahan dengan daging celeng/ babi, karena di pulau Sumatera sering ada perburuan hama babi hutan (celeng). Terdapat lima aspek perbedaan antara daging babi dan sapi  yaitu perbedaan warna, serat daging, tipe lemak, aroma, dan tekstur (Asysyaukani 2009). Namun daging celeng memiliki karakteristik fisik yang mirip dengan daging  sapi atau kerbau, sehingga sering terjadi pemalsuan  daging  sapi  atau  kerbau  dengan daging celeng. Tujuan pencampuran atau pemalsuan tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah dibandingkan jika menggunakan bahan asli, mengingat harga daging sapi terus meningkat (Margawati 2010). Oleh sebab itu, diperlukan penelitian-penelitian/metode-metode analisis yang dapat diterapkan pada permasalahan ini untuk identifikasi DNA.

Metode pengujian yang handal, cepat, sensitif dan akurat untuk pembuktian hukum, jaminan dan perlindungan konsumen adalah  hal yang  penting  dan krusial. Salah  satu metode pembuktian identifikasi DNA dengan metode reaksi rantai polymerase (PCR) (Matsunaga et al. 1999).

Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut telah memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode dilakukan untuk menentukan apakah hasil analisis suatu metode telah sahih dan dapat dipertanggungjawabkan. Validasi metode ekstraksi DNA berguna untuk memastikan bahwa hasil ekstraksi yang dihasilkan sahih terhadap parameter-parameter uji validasi yang dilakukan, sehingga didapatkan mutu DNA yang baik serta hasil analisis DNA yang baik dan sahih (Andika, 2012).

UPTD Pelayanan dan Pengujian Veteriner Provinsi Banten telah melaksanakan identifikasi DNA metode reaksi rantai polymerase (PCR) dengan menggunakan alat Pockit Nucleid Acid Analyzer. Penelitian ini bertujuan memvalidasi metode ekstraksi DNA pada alat Pockit Nucleid Acid Analyzer dalam produk daging sapi yang dicampur daging babi pada alat untuk melihat keabsahan hasil uji. Selain itu,  penelitian ini untuk mengetahui jumlah cemaran terkecil yang masih dapat diidentifikasi pada alat Pockit Nucleid Acid Analyzer.

Material dan Metode

Bahan yang digunakan daging sapi murni dan daging babi murni, ethanol 95%. Alat  yang  digunakan  alat  Pockit  Nucleid  Acid  Analyzer,  IQ  Plus™,  Porcine Ingredient Reagent Set, mikrotube, spin column collection tube,Blender atau Stomacher,  timbangan,  gunting,     centrifuge, pipet tetes, mikropipet, pipette    tips

(volume 10-100 µLdan 100-1000 µL) dan alat PCR Pockit.

Preparasi Reagen

Reagen menggunakan IQ Plus™, yang terdiri dari spin column collection tube, Solution 1, solution 2 (ditambahkan 48 ml 95% ethanol), solution 3.

Proses Pembuatan Sampel Positif Dan Negatif

Sampel positif merupakan daging sapi segar  yang  sudah  dibersihkan lemaknya dipotong kecil-kecil (99.9375, 99.875, 99.75, 99.5, 99.9, 99.75, 95, dan 90%

dari 100 gram), kemudian dihomogenisasi dengan daging babi (0.0625, 0.125, 0.25,

0.5, 1, 2.5, 5, dan 10% dari 100 gram) dalam food processor, kemudian sampel dikode dalam plastik tersendiri untuk selanjutnya diekstraksi. Sampel negatif diambil sebanyak 100 gram daging sapi giling.

Ekstraksi Sampel Positif dengan IQ Plus™

Ambil Sampel sebanyak 20 mg pada mikrotube1.5 ml, kemudian tambahkan

500 µl Solution 1 pada sampel, gunakan grinder untuk homogenisasi sampel didalam tube. Tambahkan 500 µl Solution 2 pada sampel, campur dan spin selama 1 menit. Pindahkan 500 µl supernatant pada spin column & collection tube, kemudian centrifuge selama 1 menit, buang cairan pada collection tube. Tambahkan 500 µl Solution 2 pada spin column & collection tube, kemudian centrifuge selama 3 menit, buang cairan pada collection tube. Pindahkan spin column atas pada mikrotube 1,5 ml baru. Tambahkan 200 µl Solution 3 pada spin column, kemudian centrifuge selama 1 menit, hingga diperoleh NA extract pada mikrotube.

Preparasi PCR-Mix (Mastermix)

Ambil lyophilized tube (Porcine Ingredient Reagent Set) dan dilabel, dan tambahkan 50 µl premix buffer pada lyophilized tube, kemudian tambahkan 5 µl NA extract (hasil ekstraksi DNA sampel) pada lyophilized tube. Centrifuge selama 1 menit. Siapkan R-Tube dan dilabel. Pindahkan 50 µl campuran premix dan extract ke R-Tube, tutup rubber cap R-Tube dengan kencang. Centrifuge selama 10 detik untuk menghilangkan udara pada R-Tube. Running R-Tube pada mesin PCR (Pockit Nucleid Acid Analyzer), dengan panjang gelombang Ø520 nm + 550 nm.

Validasi Metode Analisis Presisi

Uji presisi dilakukan dengan mengukur ekstraksi DNA sampel positif dan negative pada Running alat Pockit Nucleid Acid Analyzer sebanyak 7 kali ulangan yang dilakukan minimal 2 penguji (intra reproducibilitas). Validitas pengujian ini mempunyai 2 aspek yaitu sensitivitas dan   spesifisitas.

Sensitivitas

Sensitifitas    =   Jum l a h P o s i t i f x 100 %

Jumlah yang seharusnya positif

Spesifisitas

Spesifisitas               =   Jum l a h Negatif x 100 %

    Jumlah yang seharusnya positif

Limit of Detection (LOD)

Validitas pengujian ini mengukur kinerja alat Pockit Nucleid Acid Analyzer jumlah analit terkecil (prosentasi kandungan babi dalam 100 gram sampel) yang masih   bias dideteksi (10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25, 0.125,0.0625%).

Hasil dan pembahasan

Tabel 1. Repitabilitas dan Intra Reproducibilitas Hasil Deteksi Kandungan Babi   Alat

Pockit Nucleid Acid Analyzer

Keterangan : DPa = Sampel Positif Penguji A; DPb = Sampel Positif Penguji B; DN = Sampel Negatif

No.       variasi cemaran                   Nomor Ulangan               

variasi cemaran tiruan daging babi dalam daging sapi dua penguji menunjukkan kesensitifitasan primer babi dalam mendeteksi DNA babi sampai konsentrasi 0.125%.

Kesimpulan

Hasil analisa menunjukan bahwa batas pengamatan pengujian Identifikasi Spesies babi pada alat Pockit Nucleid Acid Analyzer pada sampel daging adalah 0.125 %. Hasil analisa menunjukan bahwa nilai sensitifitas, spesifitas dan efficiency adalah    100 %. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa metode ini merupakan metode valid.

Saran

Hasil validasi alat Pockit Nucleid Acid Analyzer perlu dilakukan kajian lebih lanjut untuk unjuk kerja alat dan kajian eksternal banding alat.